Εφαρμοσμένη Ενζυμολογία (Ε)

Η ανίχνευση της αιθανόλης στα τρόφιμα και διάφορα ποτά, γίνεται σήμερα με μία σύγχρονη μέθοδο που βασίζεται σε δύο ενζυμικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές είναι γνωστές στην αλκοολική ζύμωση. Η πρώτη αντίδραση της οξείδωσης της αιθανόλης προς ακεταλδεϋδη,  πραγματοποιείται παρουσία του ενζύμου αλκοολική αφυδρογονάση (ADH) και η οξείδωση της ακεταλδεϋδης σε οξικό οξύ παρουσία του ενζύμου αλδεϋδική αφυδρoγoνάση  (Al-DH).

Στόχοι Ενότητας

Να εξοικειωθούν οι φοιτητές με τη χρήση των ενζυμικών  ΚΙΤ.

Να γίνει εκμάθηση της λειτουργίας των φασματοφωτομέτρων μονής και διπλής δέσμης.

Να γίνει κατανοητός ο υπολογισμός της συγκέντρωσης αγνώστου δείγματος αιθανόλης, βάσει των μετρήσεων που έχουν λάβει.

Βιβλιογραφία

1. Beutler, H. –O. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 3rd ed., ν ΝI, pp. 598-606; Νerlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel
2. Boehringer Mannheim Biochemica “Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis” 1987
3. Boehringer Mannheim Biochemica “Methods of Enzymatic Food Analysis” 1984

Λέξεις Κλειδιά

Ενζυμική αντίδραση, αιθανόλη, NAD, NADH, αλκοολική αφυδρογονάση, αλδεϋδική αφυδρογονάση.

Ο προσδιορισμός της γλυκόζης και της φρουκτόζης σε διάφορα τρόφιμα και ποτά, μπορεί να γίνει με μέθοδο που βασίζεται σε τέσσερες ενζυμικές αντιδράσεις που είναι πολύ γνωστές και αντιπροσωπεύουν μέρος της αλυσίδας ενζυμικών αντιδράσεων της γλυκoλυτικής oδoύ (ΓΛΥΚΟΛΥΣΗΣ).

Η μέθοδος αυτή απλουστεύεται αρκετά με την χρησιμοποίηση των ενζυμικών ΚΙΤ που περιέχουν όλα τα απαραίτητα ένζυμα των αντιδράσεων σε μορφή εναιωρήματος.

Στόχοι Ενότητας

Να εξοικειωθούν οι φοιτητές με τη χρήση των ενζυμικών  ΚΙΤ.

Να γίνει εκμάθηση της λειτουργίας των φασματοφωτομέτρων UΝ μονής και διπλής δέσμης.

Να γίνει κατανοητός ο υπολογισμός της συγκέντρωσης γλυκόζης και φρουκτόζης  αγνώστου δείγματος, βάσει των μετρήσεων που έχουν λάβει.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6^η Εκδοση Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη 1989
2. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία –Τεύχος Β2 », Θεσσαλονίκη 1976
3. Bernt, E. & Bergmeyer, H.U. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) ν 3, pp. 1304-1307; Νerlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London.
4. Boehringer Mannheim Biochemica “Methods of Enzymatic Food Analysis” 1984
5. Lubert Stryer, « Βιοχημεία », Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1997

Λέξεις Κλειδιά

Εξοκινάση (ΗΚ), γλυκόζη-6-φωσφoτοαφυδρογονάση (G6P-DH), ισομεράση της φωσφορικής γλυκόζης (PGI),  ΑΤΡ,  NADP,  6- Φωσφορική γλυκόζη, 6-Φωσφορική φρουκτόζη, 6-Φωσφογλυκουρονικό (φωσφογλυκονολακτόνη).

Σκοπός της εργαστηριακής άσκησης είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός της γλυκερίνης με χρήση ενζυμικών αντιδράσεων με εφαρμογή στα τρόφιμα και ποτά.

Ως γνωστόν η γλυκερίνη αποτελεί παραπροϊόν της αλκοολικής ζύμωσης και επομένως μπορεί να βρεθεί σε μικρές ποσότητες στα κρασιά.

Η μέθοδος αυτή μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της γλυκερίνης στα διάφορα καλλυντικά, στα οποία συναντάται σε χαμηλές συγκεντρώσεις.

Στόχοι Ενότητας

Να εξοικειωθούν οι φοιτητές με τους ενζυμικούς προσδιορισμούς.

Να εξοικειωθούν με τη λειτουργία των φασματοφωτομέτρων UΝ μονής και διπλής δέσμης.

Να γίνει κατανοητός ο υπολογισμός της συγκέντρωσης γλυκερίνης αγνώστου δείγματος, βάσει των μετρήσεων που έχουν λάβει.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, Τ. Α. Γιουψάνη, Δ.Α. Κυριακίδη, «Ενζυμολογία» Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη 2001
2. Bοehringer Mannheim Biοchemica “Methοds οf Biοchemical Analysis and Fοοd Analysis” 1987
3. Eggstein, M. & Kuhlmann, E. (1974) in Methοds οf Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., νο 4, pp. 1825-1831; Νerlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New Yοrk and Lοndοn.

Λέξεις Κλειδιά

Γλυκερίνη, NAD, NADH, ATP, πυροσταφυλική κινάση, γαλακτική αφυδρογονάση (L-LDH), γλυκερινοκινάση (GK), φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ (PEP).

Οι λιπάσες είναι ένζυμα που έχουν την ιδιότητα να καταλύουν την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερίνη και ελεύθερα λιπαρά οξέα.

Υπάρχει κατηγορία λιπασών που υδρολύει τα τριγλυκερίδια σε διγλυκερίδια καθώς και άλλη κατηγορία λιπασών που τα υδρολύει σε μονογλυκερίδια.

Η παγκρεατική λιπάση υπάρχει στο πάγκρεας του ανθρώπου και των ζώων και υδρολύει τα τριγλυκερίδια σε γλυκερίνη και λιπαρά οξέα.

Συνήθως παραλαμβάνεται από το πάγκρεας των χοίρων.

Στόχοι Ενότητας

Στόχος της εργαστηριακής άσκησης είναι ο πειραματικός υπολογισμός της ειδικής ενεργότητας της λιπάσης και συγκεκριμένα της παγκρεατικής λιπάσης στην υδρόλυση της τριακετίνης.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6η Εκδοση, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη 1989
2. Ι. Γ. Γεωργάτσου, Τ. Α. Γιουψάνη, Δ.Α. Κυριακίδη, «Ενζυμολογία » Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη 2001
3. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία, Ενζυμα –Τεύχος Β1 », Θεσσαλονίκη 1976.
4. Alan Fersht, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Editiοn, W.H. Freeman.

Λέξεις Κλειδιά

Ειδική ενεργότητα, τριγλυκερίδια, λιπάση, τριακετίνη, υδρόλυση.

Οι λιπάσες είναι ένζυμα που έχουν την ιδιότητα να καταλύουν την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερίνη και ελεύθερα λιπαρά οξέα.

Υπάρχει κατηγορία λιπασών που υδρολύει τα τριγλυκερίδια σε διγλυκερίδια καθώς και άλλη κατηγορία λιπασών που τα υδρολύει σε μονογλυκερίδια.

Η παγκρεατική λιπάση υπάρχει στο πάγκρεας του ανθρώπου και των ζώων και υδρολύει τα τριγλυκερίδια σε γλυκερίνη και λιπαρά οξέα.

Στόχοι Ενότητας

Να κατανοήσουν οι σπουδαστές τις γενικές αρχές της κινητικής των ενζύμων.

Να κατανοήσουν τη μεθοδολογία υπολογισμού των κινητικών παραμέτρων ενός ενζύμου σε μια ενζυμική αντίδραση.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6η Εκδοση, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη 1989.
2. Ι. Γ. Γεωργάτσου, Τ. Α. Γιουψάνη, Δ.Α. Κυριακίδη, «Ενζυμολογία », Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη 2001.
3. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία, Ενζυμα –Τεύχος Β1 ».
4. Alan Fersht, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Editiοn, W.H. Freeman.
5. Lubert Stryer, « Βιοχημεία », Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1997.

Λέξεις Κλειδιά

Κινητική ενζυμικής αντίδρασης, μεγίστη ταχύτητα (Νmax), σταθερά του Michaelis (K_M), υδρόλυση τριγλυκεριδίων, λιπάση, τριακετίνη, εξίσωση Μichaelis-Μenten,   διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaνer – Burk).

Σκοπός της παρούσας εργαστηριακής άσκησης είναι ο πειραματικός προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων Νmax, Km, της παγκρεατικής λιπάσης στην υδρόλυση της τριακετίνης η οποία όμως λιπάση είναι ακινητοποιημένη σε κόκκους πολυστυρενίου.

Επίσης γίνεται ο προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων κατά την επαναχρησιμοποίηση της ακινητοποιημένης λιπάσης, με σκοπό να διαπιστώσουμε αν έχουμε στην περίπτωση αυτή μείωση ή αύξηση της δραστικότητας της, σε σχέση με την πρώτη χρησιμοποίηση της.

Στόχοι Ενότητας

Να εξοικειωθούν με τη χρήση ακινητοποιημένων ενζύμων.

Να κατανοήσουν τη μεθοδολογία προσδιορισμού των κινητικών παραμέτρων Νmax, KM μιας ακινητοποιημένης λιπάσης στην υδρόλυση της τριακετίνης και κατά την επαναχρησιμοποίηση της, με σκοπό να διαπιστώσουν αν έχουμε μείωση ή αύξηση της δραστικότητας της, σε σχέση με την πρώτη χρήση της.

Βιβλιογραφία

1. Fersht Alan, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Editiοn, W.H. Freeman.
2. Wiseman Alan “Handbοοk οf Enzyme Biοtechnοlοgy”, Ellis Hοrwοοd Ltd. 1975
3. Xaνier Malcata F., Reyes R. H., Garcia S. H., Hill G. C., Amundsοn H.C. and Jr. “Immοbilized Lipase Reactοrs fοr Mοdοficatiοn οf Fats and Οils- A Reνiew”, Νο 67, nο. 12, JAΟCS, 1990.

Λέξεις Κλειδιά

Κινητική ενζυμικής αντίδρασης, μεγίστη ταχύτητα (Νmax), σταθερά του Michaelis (KM), υδρόλυση τριγλυκεριδίων, ακινητοποιημένη λιπάση, τριακετίνη, διάγραμμα διπλού αντιστρόφου.

Περιγράφεται ο τρόπος προσδιορισμού της ενεργότητας ενός ενζύμου σε ένα  διάλυμα ή ένα βιολογικό υγρό. Για τον προσδιορισμό της ενζυμικής ενεργότητας μετριέται η εξαφάνιση του υποστρώματος ή η εμφάνιση του προϊόντος σε συνάρτηση με το χρόνο. Συνήθως χρησιμοποιείται η μέτρηση της εμφάνισης του προϊόντος η οποία γίνεται με χημικές και φασματοφωτομετρικές μεθόδους.

Στόχοι Ενότητας

Να γίνουν κατανοητές οι έννοιες ενεργότητα ενζύμου, ειδική ενζυμική ενεργότητα.

Να γίνει κατανοητός ο ποσοτικός προσδιορισμός της δράσης ενός ενζύμου σε ένα υπόστρωμα από το προϊόν που παράγεται.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6^η Εκδοση, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη.
2. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία, Ενζυμα –Τεύχος Β1 ».
3. Alan Fersht, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Editiοn, W.H. Freeman.

Λέξεις Κλειδιά

β-γλυκοζιδάση, π-νιτροφαινόλη, π-νιτροφαινυλο-γλυκοπυρανόζη, αρχική ταχύτητα, ειδική ενζυμική ενεργότητα.

Υδρόλυση της π-νιτρο-φαινυλο-γλυκοπυρανόζης παρουσία ενζύμου β-γλυκοζιδάση. Μέτρηση της  παραγόμενης π-νιτροφαινόλης φασματοφωτομετρικά. Υπολογισμός των κινητικών παραμέτρων Νmax, KM της β-γλυκοζιδάσης.

Στόχοι Ενότητας

Η χρήση της μεθόδου του διπλού αντιστρόφου για τον προσδιορισμό των Νmax, K_M.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6η Εκδοση, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη
2. Ι. Γ. Γεωργάτσου, Τ. Α. Γιουψάνη, Δ.Α. Κυριακίδη, «Ενζυμολογία », Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη 2001
3. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία, Ενζυμα –Τεύχος Β1 ».
4. Alan Fersht, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Edition, W.H. Freeman.
5. Lubert Stryer, « Βιοχημεία », Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1997

Λέξεις Κλειδιά

β-γλυκoζιδάση, π-vιτρoφαιvόλη, π-vιτρo-φαιvυλo-γλυκoπυραvόζη, κινητικές παράμετροι ενζυμικής αντίδρασης, αρχική ταχύτητα, διάγραμμα διπλού αντιστρόφου.

Μέτρηση των κινητικών παραμέτρων Νmax, KM της β-γλυκοζιδάσης (β-glycοsidase) κατά την υδρόλυση π-νιτροφαινυλο-γλυκοπυρανόζης (p-nitrοphenοl-glycοpyrοnοside), παρουσία και απουσία αναστολέα.

Στόχοι Ενότητας

Να μπορούν οι φοιτητές να υπολογίσουν το είδος της ενζυμικής αναστολής κατά την υδρόλυση της π-νιτρο-φαινυλο-γλυκοπυρανόζης παρουσία λακτόζης, από τη μέτρηση των κινητικών παραμέτρων Νmax, KM της αντίδρασης.

Βιβλιογραφία

1. Ι. Γ. Γεωργάτσου, « Βιοχημεία ».Τόμος Α’ – 6^η Εκδοση, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη 1989
2. Ι. Γ. Γεωργάτσου, Τ. Α. Γιουψάνη, Δ.Α. Κυριακίδη, «Ενζυμολογία » Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη 2001
3. Τρακατέλλη Αντώνη, «Βιοχημεία, Ενζυμα –Τεύχος Β1 ».
4. Alan Fersht, “Enzyme Structure and Mecanism”, 2nd Editiοn,W.H. Freeman.
5. Lubert Stryer, « Βιοχημεία », Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1997

Λέξεις Κλειδιά

Αναστολέας, β-γλυκoζιδάση, π-vιτρoφαιvόλη, π-vιτρo-φαιvυλo-γλυκoπυραvόζη, κινητικές παράμετροι ενζυμικής αντίδρασης, , διάγραμμα διπλού αντιστρόφου.

Περιγράφονται όλες οι ενζυμικές μέθοδοι προσδιορισμού ενώσεων που δίνονται σε αυτό το εργαστήριο είναι τεχνικές που βασίζονται στην μέτρηση στο UV της αύξησης ή της μείωσης της απορρόφησης του συνενζύμου NADH ή NADPH.

Στόχοι Ενότητας

Να εξοικειωθούν οι φοιτητές με τους ενζυμικούς προσδιορισμούς.

Να γίνει εκμάθηση της λειτουργίας των φασματοφωτομέτρων UV μονής και διπλής δέσμης.

Να γίνει κατανοητός ο υπολογισμός της συγκέντρωσης L-Μηλικού οξέος, βάσει των μετρήσεων που έχουν λάβει.

Βιβλιογραφία

1. Boehringer Mannheim Biochemica “Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis” 1987.
2. Boehringer Mannheim Biochemica “Methods of Enzymatic Food Analysis” 1984.
3. Lubert Stryer, « Βιοχημεία », Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1997.
4. Mollering, H. (1985) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 3^rd, vol. VII, pp. 39-47, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel.
5. Ribéreau- Gayon, D. Dubourdieu, B. Donèche, A. Lonvaud, «Handbook of Enology, Volume 1, The Microbiology of Wine and Vinifications», 2000 John Wiley & Sons, Ltd.

Λέξεις Κλειδιά

L-Μηλικό, μηλική αφυδρογονάση, NAD/NADH, γλουταμινικό οξύ, ασπαραγινικό, οξαλοξικό, α-κετογλουταρικό, τρανσαμινάση του γλουταμινικού–οξαλοξικού.